PCR 優(yōu)化的一般指導原則                

概述
NEB 針對基于 PCR 的應用提供多種 DNA 聚合酶。在產(chǎn)品的說明書或產(chǎn)品的網(wǎng)頁介紹上可以找到針對不同產(chǎn)品的特定優(yōu)化建議。下面的一般指導原則將幫助您的 PCR 實驗順利進行。

反應建立指南

DNA 模板
? 盡可能使用高質(zhì)量、經(jīng)過純化的 DNA 模板。擴增未純化的DNA 時（菌落 PCR 或直接 PCR），請參閱特定 的產(chǎn)品信息
? 對于低復雜度的模板（如質(zhì)粒、λ或BACDNA），每 50 μl 反應體系加入 1 pg-10 ng DNA
? 對于高復雜度的模板（如基因組DNA），每 50 μl 反應體系加入 1 ng-1 μg DNA
? DNA 濃度增高會降低擴增特異性，尤其是循環(huán)次數(shù)較多時
 

引物
? 一般長度為 20-40 個核苷酸
? 理想的 GC 含量為 40-60%
? 引物的 Tm 值可通過 NEB 的 Tm Calculator 計算 (www.neb.com/TmCalculator)
? 退火溫度應根據(jù)特定酶的推薦溫度設定。請注意 Q5? 和 Phusion?* 推薦的退火溫度是特別的
? 兩條引物間 Tm 差值應在 5℃ 以內(nèi)
? 避免引物形成引物內(nèi)二級結(jié)構(gòu)（如發(fā)卡結(jié)構(gòu)）以及引物二聚體
? 每條引物的終濃度應為 0.05-1 μM。請參閱特定酶的詳細推薦信息
? 引物濃度過高可能導致非特異性引物結(jié)合，并產(chǎn)生非特異性擴增產(chǎn)物
? 當擴增產(chǎn)物的大小超過 20 kb 時，引物長度應≥ 24 個核苷酸，GC 含量應在 50% 以上，Tm 值應在 60℃ 以上
? 當引入限制性位點時，需要在識別位點 5′ 端額外添加 6 個堿基
? 為了消除引物降解以及后續(xù)的非特異擴增，可使用熱啟動聚合酶（如 One Taq^? 熱啟動 DNA聚合酶或 Q5 熱啟動超保真 DNA 聚合酶）

鎂離子濃度
? 對于大多數(shù) PCR 聚合酶，Mg²⁺ 最佳濃度通常為 1.5-2.0 mM
? NEB 提供的大多數(shù) PCR 緩沖液在 1 倍濃度下已含有足夠濃度的 Mg²⁺關(guān)于 Mg²⁺ 請參閱特定酶的產(chǎn)品信息
? NEB 提供多種不含 Mg²⁺ 的緩沖液,在需要嚴格控制 Mg²⁺ 濃度的實驗中,可向其中補加 Mg²⁺
? 如果需要，可通過將 Mg²⁺ 濃度增加 0.2–1 mM來進一步優(yōu)化。在某些特定試驗中，聚合酶可能需要高達6mM 的鎂離子
? Mg²⁺ 濃度過高可能導致出現(xiàn)非預期 PCR 產(chǎn)物
? Mg²⁺ 濃度過低可能導致反應失敗
 

dNTPs
? 理想的 dNTP 濃度通常為每種 200 μM，但是某些聚合酶可能需要每種 dNTP 的濃度高達 400 μM。請參閱特定產(chǎn)品的說明書獲取詳細的推薦信息
? 過量的 dNTP 會螯合 Mg²⁺ 并抑制聚合酶的活性
? dNTP 濃度過低可增加保真性，但會減少產(chǎn)量
? 當使用古生菌 PCR 聚合酶時，引物、模板或dNTP 混合液中的尿嘧啶會導致反應失敗。針對這類反應可使OneTaq 或 Taq DNA 聚合酶聚合酶濃度
? 反應中的最佳聚合酶濃度因酶而異。請參閱特定產(chǎn)品的說明書獲取詳細的推薦信息
? 一般而言，過量的聚合酶會導致擴增失敗，特別是擴增長片段時
 

建立反應
? 除非使用熱啟動聚合酶（如 OneTaq 熱啟動DNA 聚合酶或 Q5 熱啟動超保真 DNA 聚合酶）否則需在冰上混合各種反應組份
? 盡可能最后加入聚合酶
? 建立好反應體系后立即放入已經(jīng)預熱至變性溫度的熱循環(huán)儀中。請注意在使用熱啟動聚合酶（如 OneTaq 熱啟動 DNA 聚合酶或Q5 熱啟動超保真 DNA 聚合酶）時無需預熱熱循環(huán)儀

循環(huán)條件指南

變性
? 最佳的變性溫度范圍為 94℃-98℃，并因酶而異。請參閱特定產(chǎn)品的說明書獲取詳細的推薦信息
? 避免長時間或高溫度溫育（除非模板富含 GC）
? 通常，熱循環(huán)過程中變性時間為 5-30 秒
? NEB 提供基于核酸適配子的熱啟動聚合酶，無需額外變性步驟以激活聚合酶
 

退火
? 引物的 Tm 值可通過 NEB 的 Tm Calculator 計算 (www.neb.com/TmCalculator)
? 除 Q5 超保真 DNA 聚合酶或 Phusion 超保真DNA 聚合酶*以外，退火溫度一般設定為比引物對的最低 Tm 值低 2℃-5℃
? 使用 Q5 超保真 DNA 聚合酶或 Phusion 超保真 DNA 聚合酶*時，退火溫度一般設定為比引物對的最低 Tm 值高 0℃-3℃。請參閱特定產(chǎn)品的參考文獻獲取詳細的推薦信息
? 通過優(yōu)化退火溫度或改用熱啟動 DNA 聚合酶（如 OneTaq 熱啟動 DNA 聚合酶或 Q5 熱啟動超保真 DNA 聚合酶）可避免形成非特異產(chǎn)物
? 通過溫度梯度 PCR 可優(yōu)化退火溫度，將起始溫度設定為比引物對的最低 Tm 值低 5℃
? 理想狀態(tài)下，引物 Tm 值應比延伸溫度低。但是，如果計算出的 Tm 值比延伸溫度高，可采用兩步法 PCR（將退火和延伸合并為一步）

延伸
? 推薦的延伸反應溫度范圍為65℃-72℃，因酶而異。請參閱特定產(chǎn)品的說明書獲取詳細的推薦信息
? 延伸速率因酶而異。一般而言，延伸速率范圍為15-60 s/kb。請參閱特定產(chǎn)品的說明書獲取詳細的推薦信息
? 過長的延伸時間會增加錯配率，增加非特異擴增和/或減少擴增產(chǎn)量

PCR 問題解決指南                

下面的指南可用于解決 PCR 反應中出現(xiàn)的問題。關(guān)于優(yōu)化反應的更多建議可訪問 NEB 網(wǎng)站的技術(shù)參考部分。

內(nèi)切酶在 PCR 混合物中的活性              

通常，PCR 反應后還要對產(chǎn)物進行酶切才能進行下一步工作。為了方便起見，可以將內(nèi)切酶直接加到 PCR 反應產(chǎn)物中，而省略純化 PCR 產(chǎn)物的步驟。下表歸納了在 Taq、Phusion*、OneTaq 和 LongAmpTaq PCR 產(chǎn)物混合物中各種限制性內(nèi)切酶的酶切活性。50 μl 反應體系中，將 5 單位內(nèi)切酶加入到 PCR 反應產(chǎn)物中，在適當?shù)臏囟认路磻?1 小時，凝膠電泳分析酶活性。PCR 反應產(chǎn)物中包括：1X ThermoPol 反應緩沖液、標準 Taq 反應緩沖液、Phusion HF 反應緩沖液、OneTaq 標準反應緩沖液或 LongAmpTaq 反應緩沖液，含 dNTPs（終濃度為 200 μM）、1 μg DNA 和 1 單位 Taq DNA 聚合酶。

注意：聚合酶在切割 DNA 后仍然有活性，并能改變切割的 DNA 片段末端，對后續(xù)的連接反應造成影響。含有限制性內(nèi)切酶識別位點的引物在酶消化過程中有競爭抑制作用。在非最佳條件下進行酶切反應容易出現(xiàn)星號活性。如果遇到上述任何問題，則需用乙醇沉淀，酚/氯仿抽提或離心柱純化 DNA。

圖例
使用 5 單位內(nèi)切酶切割 PCR 混合物：
+++ 表示完全切割                                              ++ 表示 ~ 50% 被切割
+ 表示 ~ 25% 被切割                                         - 表示未被切割

北京百靈克生物科技有限責任公司

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